Product # LT-KDMB-A1 Ludger Document # LT-KDMB-A1-Guide-v6.3 

LudgerTagTM DMB 唾液酸放行和貼標試劑盒產品指南

Ludger LT-KDMB-A1說明書

LT-KDMB-A1 的質量標準

LT-KDMB-A1

應用 用于從糖蛋白中釋放唾液酸，并用 1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯標記。2HCl (DMB)。

染料性質 相對分子量 = 225.07 gmol-1

熒光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。

結構

別名 DMB；1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯2鹽酸鹽；1,3-苯并二氧雜-5,6-二胺2鹽酸鹽；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧雜

性狀 該試劑盒包含用于從糖蛋白中釋放唾液酸的試劑。釋放的唾液酸通過胺化環(huán)化反應與 DMB 染料結合。

樣本數量試劑盒包含多達 22 個樣本的試劑和材料，包括唾液酸參比組、N-乙酰神經氨酸和 N-羥乙酰神經氨酸定量標準品。

樣品量 每次分析通常從 50-200µg 糖蛋白開始。我們建議一式三份分析樣本。

合適的樣本 糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的任何唾液酸均可被標記。

儲存： Store at -18 ℃ 下避光儲存。避免熱源、光和濕氣。供應的試劑可穩(wěn)定儲存至少兩年。

運輸： 產品可在環(huán)境溫度下運輸。

處理： 確保使用的任何玻璃、塑料器具或溶劑不含糖苷酶和環(huán)境碳水化合物。所有樣本處理程序均應佩戴無粉手套，避免環(huán)境碳水化合物污染。

單個小瓶試劑開封后，應立即使用其內容物。根據當地安全規(guī)則丟棄任何多余部分。

安全性： 僅供研究使用。不適用于人類或藥物

請閱讀所有所用化學品的安全數據表 (SDS)。涉及標記試劑的所有過程均應使用適當的個人安全防護 – 眼鏡、耐化學腐蝕手套（如丁腈），并在適當的實驗室通風櫥中進行。

套件內容物

每個試劑盒包含以下各一瓶：

所需的其他試劑和設備

· 加熱塊、烘箱或類似的干式加熱器，設置為 80 ℃ 用于釋放唾液酸；設置為 50 ℃ 用于唾液酸標記反應

· 移液器范圍 1 至 1000µL 和吸頭

· 真空離心機

· 反應瓶（例如 0.5 mL 聚丙烯瓶）

· 分析級水，例如。MilliQ

· 如果需要重復，則添加唾液酸標準品 [可選]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01

· 附加唾液酸標準品 Neu5,9Ac2 [可選]： CM-NEU5,9AC-01

· 工藝陽性對照品 [建議]：Ludger 胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U

Ludger Bioquant 糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U

貼標時間線

LudgerTag™ 標記程序，包括干燥時間和從

分析樣品，通常需要 7 小時加上干燥：

程序 時間

樣品制備 10 min + 干燥 (1-2 h) 可在前一天進行

唾液酸的釋放 3 h

DMB 標記 3.5 h

總時間： 干燥后 7 h

方法

1 樣品制備

· 我們建議在整個分析過程中取三份重復等份樣本。對于高唾液酸化糖蛋白，使用 50µg，對于具有低水平唾液酸化的 IgG 等樣品，使用高達 200µg。

• 請注意，一些常用于蛋白質的鹽/緩沖液可能干擾唾液酸分析過程。這取決于與緩沖液體積相比的取樣量（因為大量緩沖液會影響酸水解過程中溶液的酸度）。在我們的  當樣品濃度高于 1 mg/mL 且采集 50-200µg 樣品進行分析時，經驗緩沖液（如 PBS）不是問題。

· 我們建議您在整個過程中采用樣品進行多項控制：陽性過程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U 陽性過程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U 陰性過程控制：水

陰性過程對照：樣品緩沖液

· 將樣品和過程控制等分（除非已經干燥）至 0.5 mL 聚丙烯小瓶中，并在真空離心機中干燥。

2 唾液酸釋放

· 將烘箱設定為 80 °C

· 向樣品和過程控制小瓶中加入 25µL 2M 乙酸溶液。

不符合唾液酸標準品：Neu5Ac (CM-NEUAC-01)、Neu5Gc (CM-NEUGC-01)、唾液酸參比組 (CM-SRP-01) 小瓶；或 Neu5,9Ac2 (CM-Neu5,9,Ac-01)（如使用）。

· 渦旋溶解，然后短暫離心。

· 將樣品和對照品置于設定為 80 ℃ 的烘箱中，孵育 2 小時 (±5 min)。從烘箱中取出，冷卻至室溫。渦旋并短暫離心。

· 從每份樣品或過程對照品中取 5µL，轉移至 0.5 mL 聚丙烯瓶中，準備用 DMB 標記。

如果需要，酸釋放樣品可在-20 ℃ 下儲存至少 2 天 [Ref1]。

3 DMB 標簽

· 將烘箱溫度設定為 50 ℃。

· 向連二亞硫酸鈉 LT-DITHIO-01 小瓶中加入 440µL 巰基乙醇溶液 LT-MERCAPTO-01，并通過移液器吹打混勻，直至固體*溶解。

· 將該溶液全部加入 DMB Dye LT-DMB-01 小瓶中，并通過移液器吹打混勻，直至染料溶解。

將標記試劑暴露于潮濕和光照條件下，并在 60 min 內使用。

· 向各樣品和工藝對照品中加入 20µL 標記試劑，蓋上管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標記溶液位于小瓶底部。

• 向各唾液酸標準品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸參比組，如需要，加 Neu5,9Ac2）中加入 20µL 標記試劑，蓋上管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標記溶液位于小瓶底部。

將樣品、對照品和標準品置于設定為 50 ℃ 的烘箱中，并在  暗處。

在孵育期間，您可以開始調節(jié)準備用于分析的 LC– 見第 4 節(jié)。

· 從烘箱中取出小瓶，向各樣品和過程控制中加入 475µL 水，終止反應

向各唾液酸標準品中加入 480µL 水

4 LC 分析

稀釋用于標準曲線的 Neu5Ac 和 Neu5Gc 標準品（使用表 1 作為指導，因為 Neu5Gc 的含量通常低于 Neu5Ac，Neu5Gc 曲線的范圍比 Neu5Ac 低一個步驟）?；靹?。

這可以在“HPLC 條件色譜柱”運行過程中完成。

表 1. 標準品的稀釋方案

· 用水（20µL 樣品加 180µL 水）以 1:10（比例 1:9）稀釋樣品。

· 用水以 1:10（比例 1:9）稀釋工藝對照品（和 Neu5,9Ac2，如使用）。

· 請勿稀釋唾液酸參比組 (SRP)。

注：如果已知樣品具有低水平的唾液酸化（例如 IgG）-則不得用水稀釋。如果發(fā)現(xiàn) LC 峰的面積不在標準曲線范圍內，則制備濃度更高的樣品，或延長標準曲線。

樣品在自動進樣器中于 10 ℃ 避光條件下可穩(wěn)定儲存至少 72 h [Ref2]。

· 準備 LC 系統(tǒng)。確保預充溶劑管路。溶劑 A = 乙腈：甲醇：水 9:7:84

溶劑 B = 乙腈

熒光：激發(fā)波長：373 nm；發(fā)射波長：448 nm 柱溫 = 30 ℃；樣品溫度 = 10 ℃

表 2. 采用 LudgerSep-R1 色譜柱（4.6 x 150 mm，3µm 顆粒）LS-R1-4.6 x 150 進行 HPLC 分析的 30 min 運行方法。

進樣體積 = 25µL。

表 3. 采用 LudgerSep-uR2 色譜柱 (2.1 x 100 mm，1.9) 進行 UHPLC 分析的 15 min 運行方法

µm 微粒）LS-UR2-2.1 x 100。

進樣體積 = 5µL。

• 通過運行適當的方法（表 2 使用 LudgerSep-R1 色譜柱進行 HPLC 分析或表 3 使用 LudgerSep-uR2 色譜柱進行 UHPLC 分析）調節(jié)色譜柱，不進樣 2/3 次。然后注入水系統(tǒng)空白，并檢查基線是否穩(wěn)定。如果不是，則保持流動注射直至基線穩(wěn)定，或在再調節(jié)前，用 10%a 和 90%B 沖洗 30 min。

• 下次運行 2 次或更多次 SRP 唾液酸參比組進樣，直至圖譜重疊。圖譜應類似于圖 1 (HPLC) 或圖 2 (UHPLC)。然而，保留時間的變化取決于所使用的 LC 系統(tǒng)。

· LC 系統(tǒng)現(xiàn)在可以運行樣品組了。我們建議按照以下順序（表 4）：

表 4. 進樣順序

5 驗收標準

· 樣本集開始和結束時 SRP 的曲線應與小漂移重疊

例如：±0.1 min。

· Neu5Gc 和 Neu5Ac 的校準曲線的 R2 值應 > 0.99。

• 根據內部 SOP 分析的胎球蛋白的 Ludger 驗收范圍為 252 至 377 nmol/mg 蛋白（其中，例如 34µg 胎球蛋白/50U）[Ref3]。當我們收集更多 GCP-FET-50U 的內部數據時，更新了該驗收標準。在參考文獻 3 中列出了歷史驗收范圍，并進行了詳細解釋。

· 采用內部 SOP 分析的 GPEP-A2G2S2 的 Ludger 驗收范圍為 5.6-8.4 nmol。

（通過定量 NMR 測定的量±20%）

圖 1：在 LudgerSep-R1 HPLC 色譜柱上運行的 DMB 標記唾液酸參比組 (CM-SRP-01) 的色譜圖。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙酰基位置）；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的 HPLC 系統(tǒng)設置。

圖 2：在 LudgerSep-uR2 UHPLC 色譜柱上運行 DMB 標記唾液酸參比組。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙?；恢茫? = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的 UHPLC 系統(tǒng)設置。

參考文獻和相關文獻

1. Ludger 文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. DMB 標記唾液酸冷凍影響的測定。

2. Ludger 文件：唾液酸分析用胎球蛋白質量標準-v2.0. 唾液酸分析中胎球蛋白系統(tǒng)適用性標準品驗收標準的確定

3. Ludger 文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. 使用 Ludger 標準品驗證 DMB 試劑盒。

4. Ludger 文件：“定量唾液酸分析”的應用注釋 #APN002

反應機制

標記反應為 2 步工藝。

1. 一步是將閉環(huán)（環(huán)狀）唾液酸平衡至開環(huán)（無環(huán)）形式。

• 
  第二步遵循多步驟機制，其中 DMB 染料的伯氨基與 α-酮酸的羰基反應形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應，從而與染料的另一伯胺反應。重排得到熒光標記的唾液酸（二亞胺）。

故障排除

1. HPLC 信號較低。

• 酸水解不*：我們建議使用烘箱而不是加熱塊進行酸水解步驟。一些加熱塊導致樣品瓶蓋中的酸蒸發(fā)和冷凝，導致酸水解不*。我們還建議使用體積不超過 0.5 mL 的小樣品瓶進行酸水解。

· 樣品中的鹽干擾標記：鹽和緩沖液可干擾唾液酸

標記方法。如果您懷疑鹽干擾您的樣本，則在分析前將樣本透析至無鹽溶劑中。

2. 色譜圖中游離染料峰的水平較高。

• 這可能是由于光暴露過多所致。確保孵育步驟在暗處進行。標記樣品后，好立即在 LC 上運行，以避免降解，因為樣品長時間暴露于光照和高溫會導致非唾液酸特異性色譜峰增加。隨著時間的推移，該問題也可能是由 LC 色譜柱污染引起的，見下文。

· 當 DMB 標記樣本時，Neu5Ac 和 Neu5Gc 的量顯示穩(wěn)定

如果校準標準品在相同條件下儲存并同時進行分析，則在 10 ℃ 下避光儲存長達 72 小時 [參考文獻 3]。如果不可能，則 DMB 標記的樣本可以冷凍長達 2 天 [參考 1]。

3. LC 色譜峰保留時間的變化；基線不穩(wěn)定。

• 錯誤或舊 LC 溶劑。始終以相同方式制備溶劑（使溶劑達到  例如，通過將兩種溶劑混合在一起，在量筒中 1 升與單獨測量兩種溶劑并在瓶中混合是不相同的）。等度梯度對溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發(fā)，溶劑組成可能隨時間變化。

· 過量游離染料/肽等污染色譜柱可導致保留時間偏移

和色譜圖上的額外峰。對于唾液酸化水平較低的樣品（將大量蛋白進樣至色譜柱中），這可能是更多的問題。用正常運行溶劑和乙腈的 10:90 混合液以正常流速清洗色譜柱。

· (U) HPLC 系統(tǒng)的運行條件尚未優(yōu)化。一個常見變量為

評估您是否正在使用 UHPLC，是“強/弱清洗”。這些可能對色譜產生顯著影響。作為一般規(guī)則，“弱清洗”使用弱梯度條件，“強清洗”使用強梯度條件。您需要評估哪些提供了與產品指南相匹配的 SRP 跟蹤。我們建議通過使用以下方法開始 LC 優(yōu)化  弱洗。

4. 問題：標記液中有沉淀

• 盡管罕見，但在制備 DMB 標記溶液（連二亞硫酸鈉、巰基乙醇和 DMB 染料的混合物）的過程中可能會形成輕微沉淀。我們還觀察到這種情況，檢測了該混合物的標記效率，并證實沉淀物不影響標記反應。

5. 唾液酸參比組 (SRP) (U) HPLC 追蹤與指南中的追蹤不匹配

• 確保該參比標準品未進行酸處理。酸處理后，SRP 軌跡將僅包含對應于 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰。

保證和責任

Ludger 保證上述產品符合隨附的分析文件。如果產品因誤用以外的原因失效，Ludger 將根據其選擇免費更換或退還購買價格。本保證為排他性保證，Ludger 不作任何其他明示或暗示保證，包括任何暗示條件或針對任何特定目的的適銷性或適用性保證。

Ludger 不對任何附帶、間接或或或有損害負責。本產品僅用于體外研究。

文件修訂編號

文件編號：LT-KDMB-A1-Guide-v6.3